Technologie de production d'insuline

Des analyses

L'insuline est l'une des hormones produites par le corps humain lui-même, en particulier le pancréas. La violation de la sécrétion de cette substance entraîne l'apparition d'une maladie aussi grave que le diabète. Pour son traitement à l'aide d'une hormone synthétique, qui a longtemps été isolée du pancréas du bétail. Cependant, la technologie de production d'insuline à l'aide d'une bactérie très commune, Escherichia coli ou un champignon de levure, est utilisée depuis assez longtemps. L'utilisation de cette méthode vous permet d'éviter les réactions allergiques causées par une protéine étrangère, légèrement différente de celle de l'homme.

Schéma technologique

La technologie de production d’insuline comprend toutes les principales étapes de la production de produits biotechnologiques. Le résultat est un produit final cristallin, qui est ensuite utilisé pour préparer des solutions d'injection utilisées dans le traitement du diabète sucré de type I et II. L'effet principal de cette hormone dans l'organisme se manifeste par une diminution du taux de glucose dans le sang.

Les étapes de la production d'insuline seront les suivantes:

Préliminaire Elle effectue des opérations telles que la préparation et la purification de l'eau et de l'air, le nettoyage des locaux industriels et la stérilisation du matériel, l'inspection du personnel, le traitement des mains et la délivrance de chaussures et de vêtements stériles. Également au stade préliminaire, la synthèse chimique primaire des chaînes moléculaires à partir desquelles la protéine est assemblée est réalisée. La chaîne A contient 21 résidus d’acides aminés et la chaîne B contient 30 acides aminés.
Préparation de solutions nutritives et culture cellulaire. Pour que la cellule vivante produise le composé nécessaire, le gène correspondant est introduit. Pour cela, le plasmide est coupé par des enzymes spéciales, des restrictases, et les gènes codant pour la synthèse des composés nécessaires sont cousus dans celui-ci. Ensuite, en utilisant un procédé de microinjection, le plasmide modifié est renvoyé dans la cellule.
Culture de la suspension cellulaire. Les cellules génétiquement modifiées sont placées dans une solution nutritive contenant tous les ingrédients nécessaires à la croissance, à la reproduction et à la stérilisation. La culture de la culture a lieu dans des bioréacteurs spéciaux, où l'air pré-purifié est alimenté. Périodiquement, une certaine quantité de solution nutritive est ajoutée au réacteur et, simultanément, le même volume de suspension cellulaire est soutiré.
L'allocation de la culture. La séparation de la culture fluide et cellulaire est réalisée par sédimentation (sédimentation) dans des sédimentateurs spéciaux, puis par filtration, ce qui permet de préserver l’intégrité des cellules.
Purification chromatographique de la substance. Elle est effectuée sur le matériel approprié, selon différentes méthodes, notamment la chromatographie frontale, par échange d’anions et par perméation de gel.
Obtenir une molécule de protéine. Au stade de la biotechnologie, la synthèse d’une molécule d’insuline non produite a lieu. Et les deux composants de ses chaînes. Ils sont cousus après oxydation et pliage des chaînes obtenues, ce qui entraîne la formation de ponts disulfure.
Lyophilisation dans un four spécial, après quoi la préparation cristalline obtenue est contrôlée pour vérifier sa conformité à la norme, emballée, étiquetée et expédiée au consommateur.

Notre société offre, à des conditions favorables, des lignes de production toutes faites où toutes les technologies de production d’insuline sont pleinement respectées. Grâce à des calculs précis, à un support technique et informatique, ainsi qu’à la formation du personnel dans le cadre d’un programme complet, la société sera rentable et ses produits seront en demande.

Découverte d'insuline

Aujourd'hui, le diabète touche plus de 400 millions de personnes sur la planète, soit environ 8% de la population adulte du monde. Selon le registre national, plus de 3,3 millions de personnes souffrent de diabète en Russie (environ 300 000 personnes souffrent de diabète de type 1 et environ 3 millions de personnes atteintes de diabète de type 2). Toutefois, il est peu probable que ces chiffres reflètent la situation réelle. Tous ces gens, vivant tous les jours, comprennent que leur vie dépend de l'insuline.

Les premières tentatives de traitement du diabète ont été faites avant notre ère. Les médecins grecs et romains anciens utilisaient ce massage, la gymnastique, les bains, l'aromathérapie et bien plus encore. Au 19ème siècle, un régime alimentaire à base de viande pauvre en glucides a été mis au point pour les diabétiques. La première tentative de traitement du diabète avec des injections d’insuline a été faite en 1921. Le scientifique canadien Frederick Banting est devenu la première personne à utiliser l'hormone insuline pour contrôler le diabète. Il n'avait que 32 codes lorsqu'il a reçu le prix Nobel de médecine. Il a créé le médicament efficacement et sans effets secondaires réduit le taux de glucose de 28,9 à 6,7 mmol / l. Ce médicament a donné de l'espoir à beaucoup de personnes.

En 1869, le scientifique Paul Langergans découvrit des groupes de cellules dans le pancréas, qui portèrent plus tard le nom de «les îles de Langerhans». L'insuline a ensuite été isolée à partir des cellules de ces îlots. L'insuline est une hormone qui régule le métabolisme, principalement des glucides (sucres), mais aussi des graisses et des protéines. En cas de diabète dû à une exposition insuffisante à l'insuline, un trouble métabolique complexe se produit, le taux de sucre dans le sang augmente (hyperglycémie), le sucre est excrété dans l'urine (glycosurie) et des produits acides tels que la combustion des graisses sont altérés - organismes cétoniques (acidocétose).

Après la découverte de l'insuline, de nombreux scientifiques ont commencé à mettre au point des méthodes de nettoyage de ce médicament, car ce sont les impuretés qui ont un effet néfaste sur un corps affaibli.

Agilent Technologies est le leader mondial des équipements d'analyse. Les appareils d'analyse chromatographique et spectrale depuis plus d'un an ont aidé les scientifiques du monde entier à résoudre les problèmes vitaux des produits pharmaceutiques. Le contrôle de la pureté de l'insuline ne fait pas exception. Auparavant, la chromatographie liquide classique était utilisée à ces fins, tout en obtenant des résultats tout à fait acceptables:

Après de nombreuses recherches, les scientifiques ont prouvé que le polypeptide d'insuline formé, d'un poids moléculaire d'environ 6000, était efficacement identifié à l'aide des derniers développements en matière de chromatographie d'exclusion.

Avec cette nouvelle méthode, on peut comparer la «bonne insuline», stockée dans les conditions recommandées, à la «mauvaise insuline». Lorsque deux chromatogrammes se sont superposés, il s'est avéré que dans la préparation d'insuline, qui était stockée dans des conditions défavorables, la molécule cible était détruite et à la place de celle-ci, les produits de décomposition étaient identifiés sur le chromatogramme.

Mise au point et unification des méthodes d'analyse et de normalisation des préparations d'insuline par chromatographie liquide à haute pression en phase inverse (RP-HPLC) Pikhtar Anatoly Vasilievich

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Pihtar Anatoly Vasilyevich. Développement et unification des méthodes d'analyse et de normalisation des préparations d'insuline par chromatographie liquide à haute pression en phase inverse (RP HPLC): mémoire. Candidat en sciences pharmaceutiques: 15.00.02 / Pihtar Anatoly Vasilievich; [Lieu de protection: Académie de médecine de Moscou "].- Moscou, 2005.- 139 p.: Il.

Contenu de la thèse

CHAPITRE 1. Revue de littérature 11

1. Le rôle de l'insuline dans le traitement du diabète sucré 11

2. Biosynthèse et action biologique de l'insuline 12

3. Caractéristiques générales des propriétés physicochimiques et pharmaceutiques de l'insuline 15

4. Préparations d'insuline 24

5. Méthodes de production, normalisation et contrôle de la qualité des préparations d'insuline 31

6. L’utilisation de la HPLC dans l’analyse pharmaceutique de l’insuline. 46

CHAPITRE 2. Déclaration du problème 50

CHAPITRE 3. Etude de l'influence de divers facteurs sur le comportement chromatographique de l'insuline dans les conditions de RP HPLC 56

1. Méthodes et matériel 57

2. Discussion des résultats 62

2.1. L'influence de la composition de la solution tampon 62

2.2. L'effet de la concentration en sulfate de sodium 68

2.3. Effet de la température de la colonne chromatographique 70

2.4. Effet du modificateur organique 75

2.5. L'influence de la longueur du radical alkyle de la phase greffée 80

2.6 L'influence de la longueur de la colonne chromatographique 80

CHAPITRE 4. Amélioration des méthodes de pharmacopée pour l'analyse des préparations d'insuline basées sur l'utilisation de RP HPLC 82

1. Sélection des conditions optimales pour la détermination chromatographique de l'insuline et de ses impuretés dans des préparations médicinales 82

2. Caractéristiques métrologiques de la méthode 84

3. Application de la méthodologie mise au point pour le test des préparations d'insuline officielles 95

CHAPITRE 5. Mise au point de méthodes d'analyse des formes galéniques injectables d'isophane-insuline selon la méthode PF HPLC 107

1. Le choix des conditions de dosage de la protamine par chromatographie dans les formes galéniques d’isophane-insuline 110

2. Etude des profils chromatographiques de protamines isolées de différentes espèces de poissons 121

3. Méthode de dosage de la protamine dans les préparations d'isophane-insuline 123

4. Validation de la méthodologie développée 125

Conclusions générales 136

Références 139

Caractéristiques générales des propriétés physicochimiques et pharmaceutiques de l'insuline

D'un point de vue chimique, l'insuline est une petite protéine globulaire d'un poids moléculaire allant jusqu'à 6000 Da. Dans le même temps, il convient de noter que l'insuline est un nom commun pour toute une famille de protéines homologues d'origine naturelle et artificielle ayant une activité biologique caractéristique commune. La nature protéique de l'insuline a été établie en 1928 [52]. C'est parmi les protéines qui produisent la réaction du biuret et la réaction de Pauli. La structure de l'insuline a été pleinement établie au début des années 50. La composition chimique élémentaire des insulines d'origines diverses est caractérisée par les chiffres du tableau 1 [40].

Composition en acides aminés. La plupart des molécules d'insuline contiennent 51 résidus d'acides aminés, parmi lesquels 17 acides aminés présents dans la plupart des protéines connues.

Le tryptophane et la méthionine sont une caractéristique de la composition en acides aminés de l'insuline bovine, porcine et humaine. La composition en acides aminés de ces types d'insuline est présentée dans le tableau 2 [40,46].

Le contenu en cystine (6 demi-résidus de cystine) est invariant pour tous les types d'insuline. En outre, la molécule d'insuline de tous types contient 6 groupes amides (asparagine, glutamine).

Lorsque l'insuline est libérée, ainsi que la fraction principale, des fractions de formes désamidées de l'insuline peuvent être observées. Dans l'environnement acide, en cours de désamidation, les 6 groupes amides peuvent être progressivement séparés et la mobilité électrophorétique et chromatographique des changements d'insuline [40]. Les résultats de la détermination de l’ammoniac permettent de juger de la formation d’insuline désamidée. Pour la forme entièrement insuline de l'insuline, on détermine 6 moles d'ammoniac pour 1 mole de protéines et pour les formes désamidées, cette valeur peut aller de 5 à 0.

La structure primaire de l'insuline. La structure primaire de l'insuline a été déchiffrée par le groupe Sanger en 1945-1955. En utilisant un certain nombre de méthodes chromatographiques permettant de séparer et d'identifier différents peptides, acides aminés et leurs dérivés, Sanger a pu établir la structure primaire de l'insuline bovine [130,131,132,133,134,135]. D'autres études d'insulines d'origines diverses utilisant diverses méthodes physicochimiques, y compris la méthode d'Edman pour déterminer la séquence complète d'acides aminés dans des peptides longs, ont confirmé les découvertes de Sanger et de ses co-auteurs sur la structure de l'insuline [bb].

À ce jour, la structure primaire de l'insuline a été déterminée chez des représentants de 24 espèces appartenant à 4 classes d'animaux: mammifères, oiseaux, poissons et cyclostomes [14]. La recherche sur l'insuline d'origines diverses se poursuit [71,72,73].

La structure de l'insuline chez différents animaux est similaire, mais pas identique. Dans sa structure principale, l'insuline humaine est similaire aux insulines de porc, de chien, de cachalot et de lapin, ne différant que par un acide aminé [40]. Elle diffère de l'insuline de bétail par trois acides aminés. Dans une plus large mesure, l'insuline humaine n'est pas similaire à l'insuline de porc, d'oiseaux et de poisson guinéens [40]. Les différences dans la séquence d'acides aminés des insulines humaine, porcine et animale sont présentées dans le tableau 3.

En dépit des différences structurelles, tous les types d’insuline ont une activité biologique similaire, c’est-à-dire provoquer un effet hypoglycémique. Cependant, l'ampleur de l'activité biologique affichée dépend fortement de l'espèce et se situe dans la plage de 11 UI / mg (insuline de morue de la mer du Nord) à 62 UI / mg (insuline de dinde et de poulet), tandis que l'activité de l'insuline humaine est d'environ 25-30 UI. / mg [40]. Plus les différences interspécifiques sont importantes, plus l'activité biologique de l'insuline correspondante est grande.

Une molécule d'insuline fonctionnellement active est constituée de deux chaînes polypeptidiques (chaînes A et B) liées par des liaisons disulfure; une liaison est formée par les septièmes résidus d'acides aminés des deux chaînes, la deuxième liaison disulfure est formée par le 20ème résidu de la chaîne A et le 19ème résidu de la chaîne B (Figure 2). En outre, il existe une troisième liaison disulfure dans la molécule d'insuline, qui est intrachaine et relie les résidus de la 6ème et de la 11ème chaîne A [59, 117].

Structure secondaire En utilisant diverses méthodes de recherche physico-chimiques et physiques, il a été montré que la molécule d’insuline avait une structure spatiale hautement ordonnée (conformation), qui contribue à la mise en œuvre de fonctions biologiques spécifiques [14]. Dans la molécule d'insuline native, des feuilles à la fois en cc et en hélice sont présentes simultanément. En outre, il existe des zones à structure désordonnée et structure <3-петли. Участки, имеющие форму а-спирали, составляют 57 %, 6 % приходится на [3-складчатую структуру, 10 % построено в виде р-петли, оставшиеся 27 % не имеют упорядоченной структуры (рисунок 3) [25].

Lorsqu'une solution acide d'insuline (pH 2,3-2,5) est chauffée à une température de +100 ° C et rapidement refroidie à -80 ° C, il se forme une insuline fibrillaire - une forme de l'hormone complètement inactive [27]. L'introduction de fibres d'insuline fibrillaire dans une solution d'insuline active provoque une précipitation quantitative spontanée d'insuline sous forme de fibrilles [14,17].

Méthodes de production, normalisation et contrôle de la qualité des préparations d'insuline

Obtention d'espèces animales d'insuline. La production industrielle d'insuline de bœuf et de porc a été établie presque simultanément dans un certain nombre de pays, peu après la découverte de l'insuline en 1921 [63]. Depuis lors, le concept d'obtention d'insuline est resté pratiquement inchangé (tableau b) [17, 18]. Les matières premières pour la production d'espèces animales d'insuline sont le pancréas de bovins de boucherie utilisés pour l'alimentation.

La tâche la plus importante dans la production d’insuline est sa purification - la libération de substances provenant d’impuretés associées, qui réduisent l’activité biologique, provoquent des réactions immunologiques ou sont potentiellement dangereuses pour la santé du patient. Par exemple, après plusieurs années d'utilisation d'insuline mal purifiée dans le sang du patient, il peut y avoir jusqu'à 5 000 UI d'insuline liée aux anticorps. Les anticorps anti-insuline affectent de manière significative le profil de son action et contribuent ainsi au cours labile du diabète.

La première méthode de purification de l'insuline était la recristallisation en présence de sels de zinc. En 1945, il a été démontré que la recristallisation de l'insuline en sept fois réduit considérablement le niveau de réactions allergiques chez les patients, par rapport aux préparations d'insuline officielles de l'époque [63].

L'hétérogénéité des échantillons d'insuline après cristallisation et recristallisation simple est illustrée par diverses méthodes: extraction à contre-courant (PE), chromatographie de distribution (PX), chromatographie par échange d'ions (IOC), discélectrophorèse (DEP) et chromatographie par exclusion de gel (GEC) [63].

Les principales impuretés concomitantes de l'insuline sont: la proinsuline, ses intermédiaires, l'insuline dimère covalente, la mono-disamide-insuline, la monoarginine et le mono-éthylène, ainsi qu'un certain nombre de composés de poids moléculaire élevé, de nature autre que l'insuline. Une conclusion générale tirée des résultats des études, tenant compte des informations sur l'activité immunologique des impuretés détectées [138], a été la conclusion sur la nécessité d'une purification supplémentaire des insulines. Ainsi, lors de l'analyse par les méthodes DEF et GEC, un composant a été trouvé - l'insuline correspondante.

Pour résoudre le problème de la purification de l'insuline en 1950, la méthode HEC a été proposée et, en 1970, la méthode par chromatographie échangeuse d'anions (AOX). Il a été constaté que l'insuline, purifiée par la méthode AOX, contient environ 500 ppm (parties par million) d'impuretés ayant une activité proinsuline [137]. Une purification supplémentaire de l'insuline par chromatographie liquide à haute pression sur phases inversées (RP-HPLC) réduit la teneur en fractions immunogènes à la limite de leur détection [63].

Une revue des développements actuels dans le domaine de la purification chromatographique de l'insuline est présentée dans [96]. L'insuline, purifiée, séquentiellement, à l'aide d'IOC et de GEC, est appelée insuline à composant unique [63]. Obtenir de l'insuline humaine. La recherche de méthodes d'obtention d'insuline humaine était due à deux circonstances. D'une part, l'urgence du problème des matières premières dans le cas de la production d'insuline d'origine animale, d'autre part, le développement rapide de la science dans ce domaine a été une réelle opportunité de concrétiser cette idée. En 1979 et 1981 presque simultanément, deux méthodes d'obtention d'insuline humaine ont été développées - biosynthétique et semi-synthétique [102,108]. En 1981, la société Novo Nordisk a, pour la première fois au monde, lancé la production en série d’insuline humaine semi-synthétique. La méthode utilisée par la société est basée sur le remplacement enzymatique et chimique de Al dans la molécule d'insuline porcine par le reste de Tre [61]. Cette méthode dépend directement de l'obtention de la quantité requise d'insuline porcine, ce qui réduit sa valeur économique. La possibilité d'obtenir de l'insuline humaine par la méthode biosynthétique est apparue avec le développement de la technologie de l'ADN recombinant [10]. Les travaux sur la production d’insuline génétiquement modifiée ont commencé il ya environ 25 ans. En 1978, il a été signalé qu'une souche de proinsou-ling de rat producteur de E. coli avait été obtenue. En 1979, les études de Genentech ont permis de cloner dans E. coli les gènes codant pour les séquences d'acides aminés de. chaînes d'insuline A et B incluses dans la région p-halo-tacidase du plasmide pBR322 [10,102]. En 1981, on a synthétisé un analogue du gène de la mini-C-proinsuline proinsuline dans lequel le peptide C à 35 chaînons a été remplacé par un segment de six acides aminés: arg-arg-gly-ser-lys-arg et son expression dans E. coli. En 1982, Eli Lilly a lancé la première production industrielle d'insuline humaine au monde utilisant une technologie à deux chaînes mise au point en collaboration avec Genentech [102]. Actuellement, la possibilité d'obtenir de l'insuline humaine à l'aide de divers systèmes d'expression a été montrée [3,10,101,102]. D'un point de vue économique, l'utilisation de souches génétiquement modifiées de bactéries E. coli à Gram positif, dont beaucoup sont considérées comme surproductrices, présente un intérêt particulier [3]. Dans le même temps, des progrès significatifs ont été réalisés avec les cellules de levure Saccharomices cerevisiae [3.75]. Le tableau 7 répertorie les principales étapes, communes aux différents procédés de production d’insuline humaine recombinante, des étapes du processus technologique [3,10,63].

Application de la méthodologie développée pour tester les préparations d'insuline officielles

La chromatographie liquide à haute pression (CLHP) est une variante de la chromatographie en phase liquide sur colonne dans laquelle la phase mobile - éluant - traverse le sorbant remplissant la colonne à grande vitesse en raison d’une pression importante (jusqu’à 400 x 105 Pa) à l’entrée de la colonne [11].

Pour analyser des mélanges complexes de substances, la HPLC est apparue il y a un peu plus de 30 ans. L’utilisation d’absorbants d’un diamètre de particules compris entre 3 et 10 µm a entraîné une nette augmentation de l’efficacité de la séparation chromatographique par rapport à la version classique de la chromatographie liquide sur colonne. Par conséquent, la HPLC est souvent appelée chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Les caractéristiques instrumentales de l'utilisation de la CLHP sont décrites en détail dans de nombreux manuels [49.50] et dans les sections pertinentes de la pharmacopée principale [79.150]. Pour la HPLC, une large gamme de sorbants a été développée et est en cours de production. Selon les auteurs de l'enquête [51] - une centaine d'entreprises dans le monde produisent plus de 300 types de noms de sorbants. L'historique, l'état actuel et les perspectives de développement de la méthode sont discutés dans les revues [51] et [77.78].

Dans ses différentes variantes, la méthode HPLC est largement utilisée en analyse pharmaceutique (contrôle de la production et contrôle de la qualité des médicaments). La méthode est incluse dans toutes les principales pharmacopées du monde. Cette méthode est décrite en détail dans les pharmacopées européenne et américaine. La CLHP est utilisée pour identifier les médicaments, déterminer la pureté, la composition fractionnelle en poids moléculaire et l'analyse quantitative. Dans la pharmacopée américaine 28 ed. environ 30% des articles privés impliquent l'utilisation de la HPLC. Dans la Pharmacopée Européenne, 4ème éd. ce chiffre est d'environ 40%.

La première méthode chromatographique de test de l'insuline était la chromatographie liquide d'exclusion de gel basse pression (GE ZhND). Le principe de séparation dans les conditions de HPLC repose sur la capacité différente de molécules de tailles différentes à pénétrer dans les pores du gel neutre, qui sert de phase stationnaire. Le diamètre hydrodynamique du monomère et du dimère de l'insuline est proportionnel à leur poids moléculaire et est respectivement de 2,69 et 5,50 nm [115].

En 1967, en utilisant la méthode GE-IHDD, il a été démontré que les préparations commerciales d’insuline, purifiées par cristallisation, contiennent des impuretés d’un poids moléculaire supérieur au poids moléculaire de l’insuline [63]. Sur les chromatogrammes d'insuline porcine, trois pics ont été trouvés, généralement désignés par composants a, b et c. Depuis lors, un certain nombre de systèmes chromatographiques ont été proposés pour contrôler la teneur en impuretés de haut poids moléculaire dans les préparations d'insuline. La séparation a été réalisée sur des xérogels d'agarose hautement gonflants (Bio-Gel P-30, Bio-Rad Lab.) Ou de dextran (Sephadex G-50, Pharmacia Fine Chemicals), des solutions d'acide acétique 1-3 M ont été utilisées comme IF [127]. La grande sensibilité de ces sorbants à la compression à des pressions supérieures à la pression de gonflement de la matrice rend ces matériaux inutilisables pour un fonctionnement en mode HPLC.

L'utilisation de la chromatographie liquide d'exclusion de gel à haute pression (GE HPLC) pour l'analyse de l'insuline a été décrite pour la première fois en 1980, après le développement de sorbants macroporeux durs compatibles avec l'eau et résistant à des pressions élevées. Dans [151], la séparation a été effectuée sur des colonnes Protein-Pak 1-125 (Waters), TSK-Gel SW 2000 (Toho Soda Corp.), Bondagel (Pharmacia) dans des conditions de dénaturation (combinaison d'une solution à 7 M d'urée, d'acides minéraux et de substances non ioniques). détergents). La nécessité d'une analyse de l'insuline dans des conditions de dénaturation est associée à la capacité de l'insuline à s'agréger en solution. Pour la séparation de l'insuline dans les conditions de la HPLC HPLC, l'utilisation de l'acide acétique éluant «traditionnel» a également été décrite [152]. L'utilisation de l'acide acétique présente plusieurs avantages - impact minimal sur la structure native des composés séparés, disponibilité, faible coût, ainsi qu'un fait important est la capacité de l'acide acétique à supprimer l'association de l'insuline.

Actuellement, la HPLC ghvd est une méthode de pharmacopée permettant de surveiller la teneur en impuretés de haut poids moléculaire dans les substances et les formes posologiques finies. La méthode est également utilisée pour déterminer la teneur en protamine dans les préparations d’isophane-insuline.

L'utilisation de la CLHP en phase inversée (RP-CLHP) pour séparer pour la première fois l'insuline bovine et porcine a démontré la grande efficacité de cette méthode pour l'analyse de peptides analogues à l'insuline ayant une structure similaire.

Le mécanisme de séparation des protéines et des polypeptides dans les conditions de RP-HPLC repose sur l'hydrophobicité différente des molécules d'insuline et des impuretés associées. À ce jour, plusieurs dizaines de méthodes de séparation chromatographique d'insuline d'origine diverse et de leurs dérivés, y compris la pro-suline, les polypeptides pancréatiques, les dérivés de dezamido et l'insuline dimère, ont été décrites. [126] ont montré la possibilité de séparer l'insuline de poulet, de lapin, de mouton et de cheval. Les insulines humaine, de bœuf et de porc ont également été séparées. Lloyd et Corran ont publié une méthode de séparation des insulines de boeuf, de porc et humaines et de leurs formes désamidées correspondantes [104].

La séparation est effectuée sur des sorbants de gel de silice modifiés, des groupes méthyle, butyle, octyle, octadécyle et phényle en mode isocratique ou à gradient. En tant que PF, on utilise des modificateurs organiques - acétonitrile, alcool méthylique, alcool isopropylique, mélangés à des solutions tampons aqueuses contenant des sels inorganiques et des réactifs à la vapeur d'ions. La détection des pics est réalisée principalement par la méthode spectrophotométrique à une longueur d'onde de 190-220 nm. Des méthodes fluorimétriques sont également décrites [103].

L'analyse de la substance et des formes posologiques finies d'insuline par RP-HPLC est décrite dans des articles privés de la pharmacopée américaine et européenne [79, 150]. La méthode est utilisée pour tester les médicaments du groupe spécifié en termes de "Authenticité de l'insuline", "Protéines associées", "Détermination quantitative" et "Insuline en solution".

La littérature de recherche décrit également l'utilisation de la chromatographie par échange d'ions et par chromatographie d'affinité pour l'analyse de l'insuline [44,102], mais ces méthodes n'ont pas été largement utilisées dans la pratique de la pharmacopée.

Le choix des conditions pour le dosage chromatographique de la protamine dans les formes posologiques d’isophane-insuline

Une augmentation de la force ionique du PF entraîne généralement une augmentation des ratios de capacité d'insuline, ce qui peut être causé par plusieurs facteurs: - l'augmentation de la concentration en ions réduit le degré d'ionisation des groupes chargés de la molécule de protéine, augmentant son hydrophobicité / - une concentration élevée en cations contribue au filtrage des groupes de silanol libres à la surface une phase qui affaiblit l'interaction électrostatique non spécifique des groupes amino protonés de la protéine avec la matrice; - une force ionique élevée affecte la structure spatiale de l'insuline, ce qui entraîne une modification de la surface disponible pour l'interaction avec le sorbant. La concentration de sels inorganiques dans le SF affecte la forme des pics et la sélectivité de la séparation de l'insuline et de la désamido-Asn-insuline [143,144]. Avec une élution isocratique sur le sorbant LiChrosorb Сів avec une solution de phosphate de sodium 0,1 M (pH 2,3), un résultat satisfaisant n’a été obtenu que lorsque du sulfate de sodium a été ajouté à la solution tampon à une concentration de 0,1 M. La plupart des méthodes d’analyse d’insuline incluses dans les articles de pharmacopée et le traitement ND, utilisez PF sur la base de solutions tampons avec une teneur en sulfate de sodium égale à 0,2 M. Une teneur aussi élevée en sulfate de sodium a une incidence négative sur la reproductibilité des résultats chromatographiques en raison de la stratification des éluants. Les solutions salines très concentrées ont un effet négatif sur les équipements chromatographiques, réduisant leur durée de vie. Considérant que les méthodes d'analyse pharmacopées ont été développées il y a plus de 20 ans, il a paru intéressant d'étudier le comportement chromatographique de l'insuline sous OF-HPLC sur les sorbants chromatographiques de la dernière génération, en fonction de la concentration en sulfate de sodium. Dans le même temps, ils ont tenté de déterminer si une réduction de la teneur en sulfate de sodium dans du PF était admissible sans détérioration significative de la capacité de séparation du système chromatographique. À la suite des recherches, il a été constaté que l’effet de la concentration en sulfate de sodium dans le PF est différent, en fonction du type de la phase greffée, ainsi que de l’espèce de l’insuline. Sur les absorbants avec les groupes greffés C4 et C la sélectivité de la séparation des pics d'insuline humaine et d'insuline désamido-Asn -humaine ne dépend pas de la concentration en sulfate de sodium en. solution tampon 1 dans la plage de 0,05 M à 0,2 M. Sur le sorbant Diaspher-110-C18, la sélectivité de séparation de cette paire de pics a un maximum à 0,05 M et un minimum à 0,1 M (graphique 4). D'autre part, la sélectivité de la séparation des espèces animales d'insuline et de leurs formes AsnA21 désamidées correspondantes ne dépend pas de la force ionique de la solution lorsqu'elle est séparée sur le sorbant Diasphere-110-C18. Sur un sorbant avec des groupes greffés en C8, la sélectivité augmente de 1,25 à 1,28 avec une augmentation de la concentration en sulfate de sodium (figure 4). Sur un sorbant avec des groupes greffés en C4, la sélectivité de séparation dans le cas de l’insuline de boeuf est maximale à 0,1 M de sulfate de sodium et minimale à 0,2 M. Pour l’insuline de porc, il n’existe pas de maximum prononcé à une concentration de sulfate de les forces ont entraîné une diminution de la sélectivité de la séparation (figure 4). Le nombre de plaques théoriques effectives augmente avec la concentration en sulfate de sodium. La seule exception est le comportement de l'insuline humaine sur le sorbant Diasfer-110-C8 (figure 5). Le degré de séparation des pics d'insuline et de désamido-Asn-insuline augmente avec l'augmentation de la force ionique du FS, quelles que soient l'espèce d'insuline et le type de phase greffée (diagramme b). En réduisant la concentration en sulfate de sodium de 0,2 M à 0,1 M, le degré de séparation de la paire de pics sélectionnée diminue en moyenne de 5% pour les insulines humaine et porcine et de 10% pour l'insuline de boeuf. Compte tenu du fait que la valeur absolue du degré de séparation dépasse 2,0, la détérioration mesurée de la capacité de séparation de la colonne n’est, à notre avis, pas significative. Par conséquent, la concentration de sulfate de sodium dans la solution tampon PF peut être réduite de 2 fois par rapport aux méthodes d'analyse de la pharmacopée.

Dans la plupart des études sur l’analyse des protéines et des peptides, la séparation est effectuée à température ambiante. De plus, certains auteurs indiquent que l'effet de la température sur la sélectivité de la séparation est minime [48]. Cependant, à mesure que la température augmente, le processus d'échange de masse entre les phases stationnaire et mobile est accéléré, ce qui entraîne une diminution du temps de rétention des peptides et un rétrécissement des pics.

Technologie de l'insuline

Violation de la sécrétion d'insuline. L'utilisation de la photographie d'affiliation. Schéma pour l'insuline. Expression de la proinsuline dans les cellules de E. coli. Approches pour résoudre le problème du diabète. La contribution de la biotechnologie à la production industrielle d’hormones non peptidiques.

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MINISTÈRE DE L'ÉDUCATION ET DES SCIENCES DE LA RÉPUBLIQUE DU KAZAKHSTAN

L'UNIVERSITÉ AGRO-TECHNIQUE DU KAZAKH NOMMÉE APRÈS S.SEYFULLIN

Département de microbiologie et de biotechnologie

Sur la discipline "Biotechnologie mokroorganizmov"

Sur le sujet: technologie pour l'insuline

Terminé: Myrzabek M? Ldir Kurbanbek? Yzy

Vérifié: Akimbaeva A.K. (k. B. N.)

ABRÉVIATIONS ET SYMBOLES

1. Histoire de la découverte

2. Obtenir de l'insuline en biotechnologie

3. Moyens d'obtenir de l'insuline humaine

4. Expression de la proinsuline dans les cellules d'E. Coli

5. Purification de l'insuline

6. Posologie et administration

Dans ce cours, les définitions suivantes ont été utilisées:

Transporteur de protéines - assurant le transport de la protéine hybride dans l'espace périplasmique de la cellule ou du milieu de culture;

Composant d'affinité - facilite considérablement la sélection d'une protéine hybride.

L'insuline (du latin Insula - l'île) - une hormone peptidique, est formée dans les cellules bêta des îlots de Langerhans du pancréas.

Les interleukines sont un groupe de cytokines synthétisées principalement par les leucocytes (pour cette raison, la terminaison «-leukine» a été choisie).

La proinsuline est un précurseur de l'insuline synthétisée par les cellules B de l'appareil insulaire du pancréas.

Chromatographie (du grec. Chroma, chromatos - couleur, peinture), méthode physico-chimique de séparation et d’analyse de mélanges, basée sur la répartition de leurs composants entre les deux phases - stationnaire et mobile (éluant), s’écoulant à travers la stationnaire.

Encapsulation - mécanisme de langage de programmation qui restreint l'accès aux composants qui constituent un objet (méthodes et propriétés), les rend privés, c'est-à-dire accessibles uniquement à l'intérieur d'un objet.

Une protéine de fusion (protéine de fusion, également une protéine de composé chimérique) est une protéine obtenue en combinant deux gènes ou plus qui codaient à l'origine des protéines séparées.

Hormones (du grec. Hormao - mettre en mouvement, induire), hormones, substances biologiquement actives produites par les glandes endocrines ou glandes endocrines et sécrétées directement par celles-ci dans le sang.

Le diabète sucré est un groupe de maladies endocriniennes se développant à la suite d’une insuffisance absolue ou relative de l’insuline, une hormone.

La somatostatine est une hormone des cellules delta des îlots pancréatiques de Langerhans, ainsi que l'une des hormones de l'hypothalamus.

L'analyse radio-immune est une méthode de détermination quantitative de substances biologiquement actives (hormones, enzymes, médicaments, etc.) dans des fluides biologiques, basée sur la liaison compétitive des substances stables, similaires et marquées aux radionucléides, avec des systèmes de liaison spécifiques.

ABRÉVIATIONS ET SYMBOLES

HPLC - Chromatographie en phase liquide à haute performance

ADNc - acide désoxyribonucléique complémentaire

La fonction principale de l'insuline est d'assurer la perméabilité des membranes cellulaires aux molécules de glucose. Sous une forme simplifiée, on peut dire que non seulement les glucides, mais également tous les nutriments, sont finalement divisés en glucose, qui est utilisé pour synthétiser d'autres molécules contenant du carbone, et constitue le seul type de combustible pour les centrales cellulaires - les mitochondries. Sans insuline, la perméabilité de la membrane cellulaire au glucose chute de 20 fois, les cellules meurent de faim et l'excès de sucre dissous dans le sang empoisonne le corps.

L'altération de la sécrétion d'insuline due à la destruction des cellules bêta - l'insuffisance absolue d'insuline - est un élément clé de la pathogenèse du diabète de type 1. La violation de l'effet de l'insuline sur les tissus - déficit relatif en insuline - a une place importante dans le développement du diabète de type 2.

L'utilisation de la chromatographie par affinité a considérablement réduit la teneur en protéines contaminantes de la préparation de poids moléculaire supérieur à celui de l'insuline. De telles protéines comprennent la proinsuline et les proinsulines partiellement clivées, capables d'induire la production d'anticorps anti-insuline.

L'utilisation d'insuline humaine dès le début du traitement minimise les réactions allergiques. L'insuline humaine est absorbée plus rapidement et, quelle que soit la forme du médicament, son action a une durée d'action plus courte que celle de l'insuline animale. Les insulines humaines sont moins immunogènes que le porc, en particulier les insulines mixtes bovines et porcines.

Le but de ce cours est d’étudier la technologie de l’insuline. Pour atteindre les objectifs suivants ont été fixés:

1. obtenir de l'insuline en biotechnologie

2. Moyens d'obtenir de l'insuline

H. purification d'insuline

L’histoire de la découverte de l’insuline est associée au nom du médecin russe I.M. Sobolev (seconde moitié du XIXe siècle), qui a prouvé que le taux de sucre dans le sang humain est régulé par une hormone spéciale du pancréas.

En 1922, pour la première fois, un insuffisant diabétique dépassa toutes les attentes et présenta pour la première fois à un garçon de dix ans une insuline isolée du pancréas d'un animal. Un an plus tard, la société américaine Eli Lilly publia la première préparation à base d'insuline animale.

Après avoir reçu le premier lot industriel d’insuline dans les prochaines années, un énorme chemin d’isolement et de purification a été franchi. En conséquence, l'hormone est devenue disponible pour les patients atteints de diabète de type 1.

En 1935, le chercheur danois Hagedorn optimisa l'action de l'insuline dans le corps en proposant un traitement prolongé.

Les premiers cristaux d'insuline ont été obtenus en 1952 et, en 1954, le biochimiste anglais G. Senger a déchiffré la structure de l'insuline. Le développement de méthodes de purification de l'hormone à partir d'autres substances hormonales et de produits de dégradation de l'insuline a permis d'obtenir une insuline homogène, appelée insuline à un composant.

Au début des années 70. Les scientifiques soviétiques A. Yudaev et S. Shvachkin ont proposé la synthèse chimique de l'insuline. Cependant, la mise en œuvre de cette synthèse à l'échelle industrielle était coûteuse et non rentable.

À l'avenir, le degré de purification des insulines s'est progressivement amélioré, ce qui a permis de réduire les problèmes causés par les allergies à l'insuline, les troubles de la fonction rénale, les déficiences visuelles et la résistance à l'insuline immunitaire. L’hormone la plus efficace était nécessaire pour le traitement de substitution du diabète sucré: l’insuline homologue, c’est-à-dire l’insuline humaine.

Dans les années 80, les progrès de la biologie moléculaire ont permis de synthétiser les deux chaînes d'insuline humaine en utilisant E. coli, qui ont ensuite été combinées en une molécule d'hormone biologiquement active. L'insuline recombinante a été obtenue à l'Institut de chimie bioorganique de l'Académie des sciences de Russie en utilisant des souches génétiquement modifiées d'E.coli.

2. Obtenir de l'insuline en biotechnologie

L'insuline, une hormone peptidique des îlots pancréatiques de Langerhans, est le traitement principal du diabète sucré. Cette maladie est causée par un déficit en insuline et se manifeste par une augmentation de la glycémie. Jusqu'à récemment, l'insuline était obtenue à partir du pancréas d'un taureau et d'un cochon. Le médicament se différenciait des substitutions de l'insuline humaine 1 à 3 acides aminés, de sorte qu'il existait un risque de réactions allergiques, en particulier chez les enfants. L'utilisation thérapeutique à grande échelle de l'insuline était limitée par son coût élevé et ses ressources limitées. Par modification chimique, l'insuline animale a été rendue impossible à distinguer de l'homme, mais cela s'est traduit par une augmentation supplémentaire du coût du produit. [1]

Depuis 1982, Eli Lilly fabrique de l’insuline génétiquement modifiée à partir de la synthèse séparée des chaînes E. colie et B. Le coût du produit a considérablement diminué, l’insuline produite est identique à l’être humain. Depuis 1980, la presse a fait état de clonage du gène de la proinsuline, précurseur de l'hormone, qui passe à une forme mature avec une protéolyse limitée.

La technologie de l'encapsulation est également liée au traitement du diabète: des cellules pancréatiques dans une capsule, introduites une fois dans le corps du patient, produisent de l'insuline en l'espace d'un an.

Integrated Genetics a lancé la production d'hormones folliculostimulantes et lutéinisantes. Ces peptides sont composés de deux sous-unités. La question de la synthèse industrielle des hormones oligopeptidiques du système nerveux, des anképhalines, constituées de 5 résidus d’acides aminés et des endorphines, analogues de la morphine, est à l’ordre du jour. Avec l'utilisation rationnelle de ces peptides soulagent la douleur, créent une bonne humeur, augmentent l'efficacité, concentrent l'attention, améliorent la mémoire, mettent en ordre le sommeil et l'éveil. Un exemple d'application réussie de méthodes de génie génétique est la synthèse de β-endorphine à l'aide de la technologie de protéine hybride décrite ci-dessus pour une autre hormone peptidique, la somatostatine [2].

3. Moyens d'obtenir de l'insuline humaine

Historiquement, le premier moyen d’obtenir de l’insuline à des fins thérapeutiques consiste à isoler des analogues de cette hormone à partir de sources naturelles (îlots pancréatiques de bovins et de porcs). Dans les années 20 du siècle dernier, il a été constaté que les insulines bovine et porcine (dont la structure et la séquence d'acides aminés ressemblent le plus à l'insuline humaine) montrent une activité dans le corps humain comparable à l'insuline humaine. Après cela, l’insuline bovine ou porcine a été utilisée pendant longtemps pour traiter les patients atteints de diabète de type 1. Cependant, après un certain temps, il a été montré que dans certains cas, des anticorps anti-insulines bovine et porcine commençaient à s'accumuler dans le corps humain, annulant ainsi leurs effets.

D'autre part, l'un des avantages de cette méthode d'obtention de l'insuline est la disponibilité de matières premières (l'insuline bovine et porcine peut être facilement obtenue en grande quantité), qui a joué un rôle décisif dans le développement de la première méthode d'obtention de l'insuline humaine. Cette méthode s'appelle semi-synthétique [3].

Dans cette méthode de production d’insuline humaine, l’insuline de porc a été utilisée comme matière première. L'insuline porcine purifiée a été clivée par l'octapeptide C-terminal de la chaîne B, après quoi l'octapeptide C-terminal de l'insuline humaine a été synthétisé. Ensuite, il a été fixé chimiquement, les groupes protecteurs ont été retirés et l'insuline obtenue a été purifiée. Lors du test de cette méthode d'obtention d'insuline, l'identité complète de l'hormone obtenue vis-à-vis de l'insuline humaine a été montrée. Le principal inconvénient de cette méthode est le coût élevé de l'insuline résultante (la synthèse chimique de l'octapeptide est encore coûteuse, en particulier à l'échelle industrielle).

Actuellement, l'insuline humaine est principalement obtenue de deux manières: en modifiant l'insuline de porc par une méthode enzymatique synthétique et par une méthode de génie génétique.

Dans le premier cas, la méthode est basée sur le fait que l'insuline porcine diffère de l'insuline humaine par une seule substitution au niveau de l'extrémité C-terminale de la chaîne B Ala30Thr. Le remplacement de l'alanine par de la thréonine est effectué par le clivage d'alanine catalysé par une enzyme et par la fixation d'un résidu de thréonine protégé par un groupe carboxyle présent dans le mélange réactionnel en un large excès. Après clivage du groupe protecteur O-tert-butyle, on obtient l'insuline humaine. (photo 1)

Figure 1 - Schéma des méthodes de production d'insuline humaine

L'insuline était la première protéine obtenue à des fins commerciales en utilisant la technologie de l'ADN recombinant. Il existe deux approches principales pour obtenir de l'insuline humaine génétiquement modifiée. Dans le premier cas, des souches distinctes (différentes souches productrices) produisent les deux chaînes, suivies du repliement de la molécule (formation de ponts disulfure) et de la séparation du mauvais format. Dans le second cas, préparation sous la forme d'un précurseur (proinsuline) suivie d'un clivage enzymatique avec la trypsine et la carboxypeptidase. Dans la forme active de l'hormone. Le plus préférable actuellement est la production d’insuline en tant que précurseur, assurant la fermeture correcte des ponts disulfure (dans le cas de la production séparée de chaînes, des cycles consécutifs de dénaturation, de séparation du mauvais formage et de renaturation sont effectués [3].

Dans les deux approches, il est possible d'obtenir individuellement les composants de départ (chaînes A et B ou proinsuline) et en tant que partie de protéines hybrides. En plus des chaînes A et B ou de la proinsuline, la composition des protéines hybrides peut être présente:

1) protéine porteuse - assurant le transport de la protéine hybride dans l'espace périplasmique de la cellule ou du milieu de culture;

2) composant d'affinité - facilite considérablement la sélection d'une protéine hybride.

En même temps, ces deux composants peuvent être simultanément présents dans la composition de la protéine hybride. En outre, lors de la création de protéines hybrides, le principe de multidimensionnalité peut être utilisé (plusieurs copies du polypeptide cible sont présentes dans la protéine hybride), ce qui permet d’accroître considérablement le rendement du produit cible [4].

Nous avons utilisé la souche JM 109 N1864 avec une séquence nucléotidique incluse dans un plasmide exprimant une protéine hybride, qui consiste en une proinsuline linéaire et un fragment de fragment de protéine Astaphylococcusaureus attaché à son extrémité N-terminale par un résidu méthionine. La culture de la biomasse saturée de cellules de la souche recombinante garantit le début de la production de la protéine hybride, dont l'isolement et la transformation séquentielle par l'intube conduisent à l'insuline. Un autre groupe de chercheurs a reçu dans le système d’expression bactérienne une protéine de fusion recombinante composée de proinsuline humaine et d’une queue de polyhistidine qui lui est attachée via un résidu méthionine. Il a été isolé par chromatographie sur chélate sur des colonnes de Ni-agarose à partir de corps d'inclusion et a été digéré avec du bromure de cyanogène. Les auteurs ont déterminé que la protéine isolée est S-sulfurée. La cartographie et l'analyse par spectrométrie de masse de la proinsuline obtenue, purifiée par chromatographie échangeuse d'ions sur résine échangeuse d'anions et HPLC (phase inversée), ont montré la présence de ponts disulfure correspondant aux ponts disulfure de la proinsuline humaine native. Il a également fait état du développement d'une nouvelle méthode améliorée d'obtention d'insuline humaine par des méthodes de génie génétique dans des cellules procaryotes. Les auteurs ont constaté que l'insuline obtenue dans sa structure et son activité biologique est identique à l'hormone isolée du pancréas [5].

Récemment, une attention particulière a été accordée à la simplification de la procédure de production d'insuline recombinante par des méthodes de génie génétique. Ainsi, une protéine de fusion constituée d'un peptide leader de l'interleukine lié à l'extrémité N-terminale de la proinsuline a été obtenue via un résidu de lysine. La protéine était efficacement exprimée et localisée dans des corps d'inclusion. Après isolement, la protéine a été clivée avec de la trypsine pour produire de l'insuline et du peptide C. Un autre groupe de chercheurs a agi de la même manière. La protéine de fusion constituée de proinsuline et de deux domaines synthétiques de la protéine A de Staphylococcus, qui se lie à l’IgG, était localisée dans des corps à inclusion, mais avait un niveau d’expression plus élevé. La protéine a été isolée par chromatographie d'affinité en utilisant des IgG et traitée avec de la trypsine et de la carboxypeptidase B. L'insuline résultante et le peptide C ont été purifiés par RP-HPLC. Lors de la création de structures de fusion, le rapport de masse de la protéine porteuse au polypeptide cible est très important. C’est ainsi que la conception des constructions de fusion est décrite, dans laquelle une protéine qui se lie à l’albumine de sérum humain a été utilisée comme polypeptide porteur. Un, trois et sept peptides C y étaient attachés. Les C-peptides ont été combinés tête-queue en utilisant des espaceurs d'acides aminés portant le site de restriction Sfi I et deux résidus d'arginine au début et à la fin de l'espaceur pour le clivage ultérieur de la protéine avec la trypsine. Les produits de clivage HPLC ont montré que le peptide C est clivé quantitativement, ce qui permet d'utiliser la méthode des gènes synthétiques multimères pour produire des polypeptides cibles à l'échelle industrielle.

Obtention de la proinsuline mutante, qui contenait le remplacement de Arg32Tyr. Avec le clivage conjoint de cette protéine avec la trypsine et la carboxypeptidase B, de l'insuline native et du peptide C contenant un résidu de tyrosine ont été formés. Ce dernier, après marquage 125I, est activement utilisé dans le dosage radioimmunologique [6].

Contrôle de la qualité de l'insuline

Le contenu

1. Informations générales sur l’obtention d’insuline 5

2. Méthodes utilisées pour contrôler la qualité de l'insuline 8

Références 17

Extrait du travail

1-2% de la population européenne souffre de diabète et environ 20% de ces patients ne peuvent exister sans injections d'insuline. Depuis les premières expériences sur l'utilisation de l'insuline pour le traitement du diabète en 1922, cette hormone a été isolée du pancréas d'animaux (vaches et porcs). La séquence d'acides aminés de l'insuline animale est légèrement différente de celle de l'insuline humaine.

Les insulines humaine et porcine sont particulièrement proches: dans l'insuline porcine, la thréonine C-terminale de la chaîne B est remplacée par l'alanine. Les insulines de vache et humaine se distinguent par trois résidus d’acide aminé. Ce sont ces différences qui ont déterminé l’activité immunogène accrue de l’insuline bovine par rapport à l’insuline de porc.

Presque tous les patients traités à l'insuline de vache présentaient des anticorps anti-insuline dans le sang. Les propriétés antigéniques de l'insuline ont également été partiellement déterminées par les impuretés présentes dans ses préparations. Très probablement, c’est la formation d’anticorps anti-insuline qui explique certains effets indésirables mineurs lors de l’injection d’insuline de vache, par exemple l’atrophie de la graisse sous-cutanée au site de réinjection. Dans le cas d'une insuline hautement purifiée, ces effets étaient absents.

Ensuite, grâce au génie génétique et à l'utilisation de E. Coli, de l'insuline humaine a été obtenue.

L'insuline humaine, obtenue par E. coli, a été la première protéine "génétiquement modifiée" testée chez l'homme. Des expériences menées sur des volontaires en bonne santé ont montré son innocuité (ne provoque pas de réactions allergiques ni d’autres réactions indésirables) et sa capacité à réduire le taux de glucose dans le sang lorsqu’il est administré sous la peau ou par voie intraveineuse.

Actuellement, cette insuline humaine est obtenue par de nombreux diabétiques dans le monde entier. Cela a été précédé par des essais cliniques dans lesquels les modifications métaboliques et les effets immunologiques ont été étudiés.

La pertinence de notre sujet est que la production non contrôlée ou mal contrôlée peut entraîner la libération de préparations d’insuline contaminées, ce qui peut entraîner des conséquences cliniques défavorables.

Le but de ce travail est d’étudier les méthodes utilisées dans le contrôle qualité de l’insuline.

Références

GOST R 52249-2004 "Règles de production et de contrôle de la qualité des médicaments" 2004

OFS 42-0002-00 «Endotoxines bactériennes» 2000

OFS 42-0126-09 "Analyse biologique de l'insuline"

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Bairamashvili D.I. Génie génétique de l'insuline humaine: succès et perspectives // Journal russe de la chimie. - 2005. - T. XLIX. - № 1. - pages 34-45.

Goncharenko G.G. Principes fondamentaux de la biotechnologie: méthode d'enseignement. complexe pour stud.biolog. spécial / G.G. Goncharenko, A.V. Kruk, E.M. Stepanova, A.A. Surkov, S.A. Zyatkov; Min arr. RB. - Gomel: EI “GGU im.F. Skaryna, 2008. - 282 p.

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