Détermination du glucose par la méthode de la glucose oxydase

Des analyses

La détermination de la concentration de glucose dans le sang est l’une des études biochimiques les plus fréquemment effectuées en laboratoire.

La méthode de la glucose oxydase pour la détermination du glucose dans le sang et dans l’urine est basée sur la réaction de l’oxydation du glucose en présence de l’enzyme glucose oxydase avec formation de peroxyde d’hydrogène, lequel à son tour en présence de peroxydase oxyde l’orthotolidine en produits colorés; o La concentration de glucose est promise par la quantité de produits colorés.

Comme la méthode de la glucose oxydase vise à identifier le glucose, et non tous les types de sucres, elle est utilisée dans le diagnostic différentiel des maladies suivantes:

Principe de la méthode de la glucose oxydase pour la détermination du glucose

Le glucose en présence de l'enzyme glucose oxydase est oxydé par l'oxygène atmosphérique pour former du peroxyde d'hydrogène pendant la réaction. Le peroxyde d'hydrogène en présence de l'enzyme peroxydase oxyde l'orthotoluidine pour former un composé coloré dont l'intensité de la couleur est proportionnelle à la teneur en glucose. Cette méthode vous permet de déterminer le niveau de glucose dans le plasma sanguin, le sérum et le liquide céphalo-rachidien.

Glycémie normale, mmol / l

- dans le plasma, dans le natsheartse

nouveau-nés - 1.7 - 4.2
enfants de 6 semaines à 15 ans - 3.3 - 5.4
adultes (hommes, femmes) - 3,9 - 5,6

- en sérum, en natsheartse

nouveau-nés - 2.6 - 4.2
enfants de 6 semaines à 2 ans - 3.3 - 5.4
adultes (hommes, femmes) - 3,9 - 5,6

Réactifs nécessaires pour la détermination du glucose par la méthode de la glucose oxydase

1. Chlorure de sodium à 9 grammes / litre (solution isotonique): préparé en dissolvant 0,9 g de NaCl dans 100 ml d’eau.

2. Sulfate de zinc, 50 g / l: 5 g de sulfate de zinc (ZnSO4) sont dissous dans de l’eau, le volume est porté à 100 ml.

3. Hydroxyde de sodium à 0,3 mol / l: préparé en dissolvant 1,2 g de NaOH dans 100 ml d’eau, la concentration est contrôlée par titrage (elle devrait être de 0,3 n).

4. Orthotoluidine, solution à 1%: 1 g du médicament est dissous dans 100 ml d'alcool absolu. La solution peut être conservée au réfrigérateur dans une fiole munie d'un bouchon en verre pendant plusieurs mois. Un produit disponible dans le commerce peut être purifié par recristallisation pour lequel il est dissous dans de l'alcool absolu, de l'eau est ajoutée et les cristaux précipités sont aspirés sur un filtre, puis séchés sur du chlorure de calcium.

5. Solution tampon acétate pH 4,8: mélanger 4 parties d'acide acétique 0,25 n (à contrôler par titration) et 6 parties d'acétate de sodium 0,25 n (contient 34 g de CH3COONa X ЗН2О dans 1 litre).

6. La glucose oxydase est une préparation sèche ayant une activité de 3 000 unités / mg ou plus.

7. Peroxydase de raifort. 1 mg est dissous dans 5 ml de tampon acétate, il peut être conservé au réfrigérateur pendant plusieurs jours.

8. Réactif de travail: dissolvez 2 mg de glucose oxydase et 1 mg de peroxydase dans 80 ml de tampon acétate, ajoutez 1 ml de solution d'orthotoluidine à 1%, mélangez et portez le volume à 100 ml avec une solution tampon. Le réactif de travail doit être transparent, incolore ou avoir une légère teinte verte, auquel cas il est stable lorsqu'il est stocké à froid. Si la couleur est intense ou quelques heures après la préparation, un précipité commence à tomber, ce qui signifie que l'orthotoluidine n'est pas assez pure et doit être recristallisée.

9. Solutions de glucose d'étalonnage. Le glucose est pré-séché à 37 ° C et stocké dans un dessiccateur. Tout d'abord, préparez une solution basique à la concentration de 50 mmol / l, pour laquelle 180 mg de substance sont dissous dans 20 ml d'une solution saturée (environ 0,3%) d'acide benzoïque. À partir de cette solution, préparez des solutions d’étalonnage de travail contenant 3; 6; 9; 12; 15; 18 et 21 mmol / l, pour lesquels ils prennent 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3; 3,6 et 4,2 ml de la solution basique et porter la solution saturée d’acide benzoïque à un volume de 10 ml. Ces solutions contiennent du glucose aux mêmes concentrations que dans le sang, ce qui facilite les calculs lors de l'étalonnage.

Progression de la détermination du glucose par la méthode de la glucose oxydase

Dans les tubes à centrifuger, ajoutez 1,1 ml de solution de chlorure de sodium, 0,4 ml de solution de sulfate de zinc et 0,4 ml de solution de NaOH 0,3 n, mélangez; dans le même temps, il se forme un très mince gel d'hydroxyde de zinc dans lequel sont libérés 0,1 ml de sang ou de la solution d'étalonnage, mélangés à nouveau et centrifugés au bout de 10 minutes à une vitesse de 3000 tr / min pendant 10 minutes.

A 1 ml de surnageant, ajoutez 3 ml de réactif de travail et mélangez doucement.

Une couleur commence graduellement à se développer et, à une température ambiante normale, atteint son maximum en 13 à 15 minutes, puis diminue progressivement. Photométriquement, toujours après la même période de temps après avoir ajouté le réactif de travail dans des cuvettes avec une longueur de chemin optique de 1 centimètre avec un filtre à lumière rouge (longueur d'onde 625 nm), ce qui est réglé en même temps que les échantillons de travail, mais prenez une solution physiologique de chlorure de sodium.

Lors de la préparation du graphique d'étalonnage, 0,1 ml de la solution d'étalonnage appropriée est prélevé à la place des échantillons de sang.

Le calcul du glucose peut être effectué selon la règle des proportions ou le programme d'étalonnage, afin de déterminer la concentration de glucose (mmol / l) sur un axe et la valeur d'extinction sur l'autre.

Notes sur la méthode de détermination du glucose par la méthode de la glucose oxydase

1. Vous pouvez d'abord libérer le sang de la pipette dans une solution isotonique de chlorure de sodium, puis ajouter des solutions de sulfate de zinc et de NaOH.

2. Avec un travail systématique, il n'est pas nécessaire d'établir constamment un programme d'étalonnage pour tous les points: il suffit de traiter un échantillon vierge et 2 ou 3 points dans la plage de 3 à 9 mmol / l par jour, et d'établir un programme d'étalonnage complet uniquement lors du changement de réactif ou du réglage de la procédure.

Méthode de la glucose oxydase pour la détermination du glucose

La méthode de la glucose oxydase est utilisée pour déterminer la concentration de glucose exclusivement dans divers fluides corporels. L'avantage de ce test est sa précision. Les diagnostics, contrairement aux méthodes rapides, permettent de révéler la quantité de glucose pur, sans fructose et autres sucres. Le principe de cette réaction est de colorer la solution, ce qui résulte de l’interaction des agents oxydants avec des colorants spécifiques. L'évaluation des résultats de la recherche est effectuée à l'aide de la méthode de colorimétrie et par comparaison avec des solutions étalons.

Quand prescrit-on la méthode de la glucose oxydase?

Ce test est utilisé pour détecter une altération de la tolérance au sucre et l'apparition d'un prédiabète, ainsi qu'au plus fort de la maladie. Mais l'analyse est rarement utilisée à cette fin, en raison de son coût élevé et de l'attente du résultat. Le plus souvent, la détermination du glucose dans le sang et l'urine à l'aide de cette méthode est utilisée dans le diagnostic différentiel de maladies telles que:

syndrome d'intolérance au lactose;
intolérance au fructose;
la libération de fructose avec les fluides corporels;
augmentation de la concentration de pentose dans l'urine.

L'avantage incontestable du test de la glucose oxydase est sa précision.

Quelle est la base de cette méthode?

Il existe différentes méthodes pour déterminer la concentration de glucose dans le sang, mais la glucose oxydase est la plus précise. L'essentiel est que l'interaction du sucre avec l'oxygène de l'air oxyde le réactif. Le peroxyde d'hydrogène est libéré dans la solution. Cette substance interagit avec l'orthotoluidine, formant un composé coloré. Pour le comportement de cette réaction nécessite la présence d'enzymes spéciales. La glucose oxydase doit être présente dans la réaction d’oxydation et la peroxydase dans la coloration du liquide. L'intensité de la couleur de la solution dépendra de la teneur en glucose et sera la plus intense avec sa teneur élevée.

L’essence de la méthode de la glucose oxydase pour la détermination du glucose

L'évaluation du résultat est effectuée en utilisant la méthode quantitative de photométrie au même intervalle de temps. Veillez à utiliser une solution d'étalonnage contenant un certain taux de sucre et à partir de laquelle vous pourrez évaluer la concentration de glucose dans les fluides corporels, souvent dans le sang.

Comment se déroule l'analyse?

Le matériel est prélevé chez le patient l'estomac vide. Pour le test utilisant du sang veineux en une quantité de 5 ml. À la veille du diagnostic, le patient est soumis à un régime alimentaire strict. Cela permettra de juger de la fiabilité du résultat et d'exclure d'éventuelles erreurs d'analyse. 2 jours avant le prélèvement de sang, le patient doit renoncer aux mauvaises habitudes de boire et de fumer. Il est également nécessaire de limiter la consommation de plats trop sucrés et, si possible, d'éviter les situations stressantes.

Le plus souvent, cette méthode de détermination de la concentration en glucose est réalisée par la méthode de centrifugation, qui est utilisée pour séparer les éléments mis en forme. La quantité de sucre est déterminée dans le plasma. Lorsque tous les réactifs nécessaires y sont ajoutés, la couleur est observée après 20 minutes si le test est effectué à température ambiante. Le calcul du taux de glucose est effectué conformément au programme d'étalonnage ou à la règle des portions.

Des réactifs pour la recherche

Pour déterminer le sucre est le plus pratique d'utiliser des méthodes rapides pour la détermination du glucose dans le sang. Cela est dû à la facilité d'utilisation et aux résultats rapides. De plus, le patient n'a pas besoin d'aller au laboratoire ou à l'hôpital. Mais contrairement au test de la glucose oxydase, un tel diagnostic n’est pas fiable. Comme il ne différencie pas le glucose des autres sucres et détermine leur concentration ensemble.

La réaction de la glucose oxydase est basée sur une solution de chlorure de sodium à 9% et de sulfate de zinc à 50%. Ils sont ajoutés au stade de la centrifugation du sang. En outre, utilisez une solution tampon avec de l'acide acétique et de l'acétate de sodium. La méthode de titrage détermine son pH à 4,8. Après cela, la glucose oxydase est ajoutée, ce qui provoque le peroxyde d'hydrogène et la peroxydase, qui est impliquée dans la coloration de la solution à la concentration souhaitée pour obtenir un résultat précis.

Normes en cours d'analyse

La quantité de sucre est mesurée en unités spéciales - millimoles par litre de solution.

Les analyses de sang de glucose oxydase doivent être effectuées sur un estomac vide et le plasma ou le sérum est utilisé à cet effet. Le taux de son nombre pour les adultes pour les femmes et les hommes est de 3,3-5,5. Pour les enfants de moins de 15 ans, ce chiffre est légèrement inférieur et varie entre 3,2 et 5,3. Chez les nouveau-nés, la glycémie est comprise entre 1,7 et 4,2. L'augmentation de la performance est observée avec le développement d'un patient souffrant de diabète sucré ou en violation de la tolérance au glucose. Cette condition est un prédiabète, et si elle n’est pas traitée à temps, elle conduira bientôt au développement de cette pathologie grave.

TRAVAIL N ° 1. DÉTERMINATION QUANTITATIVE DU GLUCOSE DANS LE SANG. PROCEDE ENZYMATIQUE (GLUCOSOOXIDAL)

JUSTIFICATION DE L’EXÉCUTION DU TRAVAIL. La détermination du glucose dans le sang total ou le plasma est effectuée chez chaque patient pour évaluer l'état du métabolisme des glucides et diagnostiquer la pathologie (hyperglycémie, hypoglycémie). Une méthode enzymatique basée sur l'oxydation du glucose par la glucose oxydase en acide gluconique en présence d'oxygène est utilisée pour déterminer la teneur en glucose dans le sang. La méthode est très spécifique pour la détermination du D-glucose en présence d'autres substances réductrices contenues dans des extraits de tissus et des fluides biologiques.

PRINCIPE DE LA MÉTHODE. La glucose oxydase est une enzyme complexe contenant le FAD en tant que groupe prosthétique. Lorsque le glucose est oxydé par la glucose oxydase, deux atomes d'hydrogène se séparent du premier atome de carbone de la molécule de glucose. De plus, ces deux atomes d’hydrogène sont transférés à FAD, FADH se forme₂. Ce dernier transfère des atomes d’hydrogène à l’oxygène moléculaire pour former H₂Oh₂. Alors H₂Oh₂ il est clivé par l'enzyme peroxydase en eau et en oxygène atomique, qui oxyde le chromogène (colorant) qui se colore au cours de l'oxydation.

Méthode du glucose oxydase

Aujourd'hui, les méthodes basées sur l'utilisation de l'enzyme glucose oxydase sont les plus largement utilisées. La méthode est basée sur la réaction suivante:

La glucose oxydase catalyse le transfert de deux atomes d'hydrogène du premier atome de carbone du glucose à l'oxygène dissous dans un réactif liquide. Au cours de la réaction, du peroxyde d'hydrogène est formé en quantités équimolaires. C'est à dire la concentration en peroxyde d'hydrogène formé est exactement égale à la concentration de glucose déterminée. En conséquence, l'utilisation de la réaction de glucose oxydase a transformé le problème de la détermination de la concentration en glucose en un problème de la détermination de la concentration en peroxyde d'hydrogène, qui, comme on le verra ci-dessous, est beaucoup plus simple que le premier. Et ici, il existe plusieurs méthodes largement utilisées aujourd'hui en laboratoire (voir diagramme).

Parmi les méthodes d'enregistrement ci-dessus, la méthode biochimique photométrique la plus largement utilisée, dans laquelle les molécules de peroxyde d'hydrogène sous l'action de l'enzyme peroxydase se scindent en formation de la forme oxygène actif - radical superoxyde anion - O₂ -, qui à son tour oxyde le chromogène, ce qui entraîne un changement significatif du spectre d'absorption du chromogène.

La grande popularité de cette méthode pour la détermination du glucose est due à sa grande spécificité et à sa facilité de mise en œuvre. Le procédé peut être mis en œuvre en utilisant un photomètre conventionnel, ainsi qu'en utilisant des auto-analyseurs biochimiques automatiques.

La méthode de la glucose oxydase est aujourd'hui reconnue comme l'une des méthodes quantitatives les plus précises pour la détermination du glucose. En tant que matériau biologique, on utilise le sérum et le sang total. Lors du travail avec ce dernier, il convient de prendre en compte le fait que, lors de la prise de sang capillaire, la proportion de sérum (plasma) dépend de la valeur de l'hématocrite, ce qui peut nuire à la précision du résultat. Par conséquent, lors de la détermination du glucose par le procédé décrit ci-dessus, il est préférable d'utiliser le sérum du patient.

Parallèlement à la méthode photométrique de point final, des kits dans lesquels la méthode photométrique cinétique a été mise en œuvre sont apparus. L’essence de la méthode est qu’à un certain rapport entre les activités de la glucose oxydase et de la peroxydase, le taux de formation d’un composé coloré pendant un certain temps après l’ajout de l’échantillon à la solution de travail sera proportionnel à la concentration de glucose dans l’échantillon. L'avantage de cette méthode est que le résultat ne dépend pas de la présence d'autres composés dans l'échantillon, car l'absorption de ce dernier est stable dans le temps. Cette méthode nécessite l'utilisation d'un photomètre cinétique, d'analyseurs semi-automatiques ou d'analyseurs biochimiques automatiques. La mesure de la concentration en glucose dans le sang total est effectuée de manière appropriée à l'aide d'instruments dont le fonctionnement est basé sur le principe de mesure ampérométrique, à l'aide de capteurs enzymatiques spéciaux. Le peroxyde d'hydrogène est un composé chimique extrêmement instable et peut servir de source de particules chargées. C'est ce qui est utilisé dans les capteurs enzymatiques du type à membrane ou dans les éléments électrochimiques des glucomètres portables.

En conclusion, il convient de mentionner les inconvénients de la méthode de la glucose oxydase. Le radical anhydre peroxyde d’hydrogène et superoxyde résultant peut oxyder non seulement le chromogène, mais également d’autres substances présentes dans le fluide biologique: acide ascorbique, acide urique, bilirubine. Dans le même temps, respectivement, la proportion de peroxyde qui participe à l'oxydation du chromogène diminue, ce qui entraîne une sous-estimation du résultat du glucose. Cette méthode est linéaire, en règle générale, jusqu’à 20-30 mmol / l de glucose.

Détermination quantitative de la glycémie par la méthode de la glucose oxydase

Le principe de la méthode. La méthode est basée sur la spécificité de l'action de l'enzyme glucose oxydase. Cette enzyme oxyde le glucose en présence d'oxygène moléculaire pour former de la gluconolactone, qui s'hydrolyse spontanément en acide gluconique. La glucose oxydase oxyde le glucose pour former du peroxyde d’hydrogène (H₂Oh₂) qui, sous l'action de la peroxydase, réagit avec la 4-aminoantipyrine et le phénol. Le résultat est un composé de couleur rose dont la densité optique à 510 nm est proportionnelle à la concentration de glucose dans l'échantillon.

2 N₂Oh₂ + 4-aminoantipyrine + phénol → quinone imine + 4H₂Oh

Équipement: KFK, centrifugeuse, thermostat, trépieds, tubes à essai, pipettes, matériel biologique, réactifs contenus dans la solution de travail.

échantillon d'essai, ml

échantillon standard, ml

test unique (N₂O), ml

Solution de glucose d'étalonnage (standard)

Les tubes sont incubés dans un thermostat à 37 ° C pendant 15 minutes, puis colorimétrés avec un filtre vert dans un filtre vert dans des cuvettes d'une épaisseur de couche de 5 mm contre un blanc (H₂O) La couleur rose est stable pendant 1 heure après l'incubation.

Calcul teneur en glucose produite par la formule:

C = x C standard, où

C est la teneur en glucose de l'échantillon expérimental, mol / l;

Eop est la densité optique de l'échantillon;

Est est la densité optique de l'échantillon d'étalonnage;

С standard - contenu dans la solution d'étalonnage, mol / l.

Valeurs normales:  nouveau-nés - 2,8 à 4,4 mmol / l

 enfants - 3,9 -5,8 mmol / l

 adultes - 3,9 - 6,2 mmol / l

Hypoglycémie (HGH). L'augmentation de la glycémie est due à de nombreuses raisons, selon lesquelles il existe deux groupes d'hyperglycémie.

1. Insulaire - associé à un contenu insuffisant dans le corps de l'insuline ou dû à l'inefficacité de son action.

2. Extrainsular (extrainsular) - ne dépend pas de l'effet de l'insuline.

Les processus suivants sont les plus importants dans la formation de HGH: dégradation améliorée du glycogène; augmentation de la néoglucogenèse; inhibition de la synthèse du glycogène; diminution de l'utilisation du glucose par les tissus sous l'influence d'antagonistes hormonaux de l'insuline: somatotropine, glucorticoïdes, thyroxine, thyrotropine.

L'hyperglycémie alimentaire est caractérisée par un apport excessif de glucose dans le sang (par exemple, une hyperglycémie sous charge de sucre). L'hyperglycémie "hépatique" survient dans les lésions diffuses du foie.

Une hyperglycémie persistante et grave accompagne le plus souvent le diabète sucré. Il est de coutume d'isoler le diabète sucré insulino-dépendant et le diabète sucré non insulino-dépendant ou, respectivement, le diabète sucré de type I et le diabète sucré de type II. La formation de diabète sucré de type I est principalement associée à une synthèse et à des échanges altérés d’insuline.

Le deuxième groupe d'hyperglycémie est principalement associé à l'hyperfonctionnement des glandes endocrines qui produisent des hormones - des antagonistes de l'insuline. On l'observe dans des maladies telles que le syndrome et la maladie de Cushing, l'acromégalie, la thyrotoxicose, le phéochromocytome, le glucogénome. La glycémie augmente également dans certaines maladies du foie (en particulier chez 10 à 30% des patients atteints de cirrhose du foie), l’hémochromatose (cirrhose du foie pigmentée, diabète de bronze).

Hypoglycémie (HGP) - diminution de la glycémie - le plus souvent associée à une augmentation absolue ou relative des taux d'insuline dans le sang. l'hypoglycémie Vnepankreaticheskim observée à la suite d'un déséquilibre entre la mesure où les procédés de la glycogénolyse et la néoglucogenèse dans le foie au cours de l'hépatite aiguë et chronique, la cirrhose, une maladie hépatique aiguë et subaiguë, l'intoxication alcoolique, l'empoisonnement par l'arsenic, le phosphore, au cours de la jaunisse mécanique prolongée, le foie congestive, le cancer du foie primaire ou métastatique. On observe souvent une diminution de la glycémie chez les patients atteints d'un cancer de l'œsophage et d'autres tumeurs malignes de localisation extrapancréatique (fibrome, fibrosarcome, névrome), ainsi que de vomissements indomptables, d'anorexie, de diabète hépatique, d'urémie, de lactation abondante et de glucosurie chez la femme enceinte.

L'hypoglycémie peut être d'origine centrale en raison d'un traumatisme mental, d'une encéphalite, d'une hémorragie sous-arachnoïdienne, d'une tumeur au cerveau.

1. Troubles héréditaires de la digestion des glucides.

2. Quels types d'hyperglucose connaissez-vous?

3. Quelles sont les causes de l'hyperglucosémie pathologique?

4. Quelle est la cause du diabète sucré insulino-dépendant?

5. Quelles sont les causes biochimiques des maladies héréditaires: a) glycogénose? b) aglycogénose? c) fructosémie? d) galactosémie?

6. Quels sont les changements biochimiques dans le métabolisme des glucides pendant le jeûne?

7. Principe de la méthode de détermination de la tolérance au glucose.

Méthodes de glucose oxydase et hexokinase pour la détermination du glucose sérique dans le sang

Un diagnostic précis et le traitement prescrit nécessitent une série de tests de laboratoire.

La méthode de détermination du glucose sérique est l’outil le plus important pour la détection de l’hypoglycémie et de l’hypoglycémie chez les patients atteints de diabète sucré.

La méthode permet d'ajuster les troubles métaboliques des données de traitement médical. La glycémie diagnostique peut également être déterminée dans le sang total et son plasma.

Méthodes de détermination de la glycémie

Les méthodes permettant de déterminer la quantité de glucose dans le sang se sont beaucoup développées.

Certains d'entre eux (réductionométrique, colorimétrique) ne sont pratiquement pas utilisés en raison de la haute toxicité et de la faible précision des résultats.

Les études enzymatiques les plus couramment utilisées. La méthode de la glucose oxydase est une méthode de réaction de la couleur qui se produit lorsque les glucides sont chauffés. L'hexokinase détermine l'activité du sang sur l'hexokinase.

Méthode du glucose oxydase

La méthode de la glucose oxydase pour la détermination de la glycémie repose sur sa réaction d’oxydation sous l’influence d’une enzyme. Cela forme du peroxyde d'hydrogène, il tache la substance chromogène, dont la concentration détermine la quantité de glucose.

La méthode de la glucose oxydase est utilisée pour:

intolérance héréditaire au fructose;
pentozurii;
intolérance au lactulose.

L'inconvénient de l'étude est que le peroxyde d'hydrogène est capable d'oxyder à la fois le chromogène et l'acide ascorbique, l'acide urique et la bilirubine présents dans le sang. Calculer la quantité de méthode photométrique de glucose, l'intensité de la coloration est comparée avec le graphique d'étalonnage.

En laboratoire, le niveau d'une substance peut être déterminé:

dans le sang veineux. Des analyseurs automatiques sont utilisés;
dans le sang capillaire. La clôture est réalisée à partir d'un doigt.

Le procédé électrochimique consiste à utiliser des électrodes contenant de la glucose oxydase. La quantité de peroxyde d'hydrogène générée, ou la quantité restante d'oxygène consommée au cours du processus d'oxydation, est déterminée.

Méthode à l'hexokinase

La substance est l'enzyme la plus importante du métabolisme du glucose, ce qui limite la vitesse du processus dans les cellules.

En laboratoire, sous l'action de l'hexokinase, le glucose est phosphorylé par l'adénosine triphosphate.

À la suite de la réaction, des molécules organiques se forment dont la quantité est déterminée par le niveau d'absorption de la lumière dans la zone ultraviolette. Une réaction positive trop rapide de l'hexokinase peut également être un signe de l'apparition de tumeurs malignes.

Préparation à l'analyse

Les tests de glycémie sont prescrits pour:

Avant l'analyse, vous devez respecter un certain nombre de conditions pour que les résultats soient aussi fiables que possible:

les recherches sont effectuées à jeun. Matériel pris le matin;
Quelques jours avant le diagnostic, il est nécessaire d’éviter les efforts physiques importants, le stress;
Dans le régime alimentaire quotidien du patient doit contenir au moins 150 grammes de glucides. Avec une carence, le niveau de glucose augmentera et diminuera lentement, ce qui fausserait l'analyse des données.
la veille du diagnostic ne peut pas fumer et boire des boissons alcoolisées;
il est impossible d'effectuer des recherches après des opérations lourdes, un accouchement, en présence d'inflammations. Contre-indiqué dans l'analyse de la cirrhose du foie, l'exacerbation de maladies de l'estomac, les processus tumoraux;
Quelques jours avant l’étude, on ne doit pas subir d’interventions physiothérapeutiques, prendre des contraceptifs oraux, des médicaments diurétiques, des médicaments psychotropes, de la caféine.

L'analyse peut donner un résultat faussement positif dans l'hypokaliémie et les maladies endocriniennes (syndrome de Cushing, thyrotoxicose).

Normes de glucose dans le sérum sanguin par âge

Les indicateurs normaux dépendent de l'âge:

le sang de cordon peut contenir de 2,5 à 5,3 mmol / l;
chez les bébés prématurés - de 1,1 à 3 mmol / l;
enfants du premier jour de la vie - de 2,22 à 3,33;
à l'âge de 2,7 à 4,4 ans;
chez les enfants de plus de 6 ans - de 3,3 à 5,5 mmol / l;
chez les adultes jusqu'à 60 ans - de 4,4 à 6,3;
chez les personnes âgées - de 4,6 à 6,1 mmol / l.

L'hypoglycémie chez l'adulte est diagnostiquée avec des valeurs de glucose inférieures à 3,3 mmol / l et une hyperglycémie - supérieure à 6,1 mmol / l.

Méthode au glucose oxydase pour la détermination du glucose dans le plasma

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Merci d'avoir répondu à notre question.

11/19/2009

Gerasimenko V.A., Ph.D., Kurilyak O.A., Ph.D.

Extrait des archives du journal "News A / O Unimed"

La détermination de la concentration de glucose dans le sang est l’une des études biochimiques les plus fréquemment effectuées sur le QDL. La popularité exceptionnelle du test est liée à une incidence élevée de diabète. Ce test est effectué à la fois dans des cliniques hospitalières et ambulatoires. Les patients diabétiques sont obligés d'examiner le taux de glucose dans le sang à la maison, car sans cette information, il leur est difficile d'adapter leur régime alimentaire, leur exercice physique, leur consommation d'insuline et d'autres médicaments antidiabétiques. L’importance exceptionnelle du test et le grand nombre de recherches effectuées ont incité les développeurs à créer divers types de dispositifs et de méthodes permettant de déterminer la concentration de glucose dans le sang.

Actuellement, il existe de nombreuses méthodes pour déterminer le glucose. Ils peuvent être classés comme suit.

Méthodes de dosage du glucose dans le sérum

- point final photométrique

- photométrie réfléchissante - chimie sèche

Les deux premières méthodes sont extrêmement peu pratiques, toxiques et peu précises, nous ne nous attarderons donc pas dessus.

Méthode du glucose oxydase

Aujourd'hui, les méthodes basées sur l'utilisation de l'enzyme glucose oxydase sont les plus largement utilisées. La méthode est basée sur la réaction suivante:

Sur la fig. Les figures 1 et 2 montrent les spectres de la solution de travail avant et après l'ajout de la solution de glucose standard. L'absorption maximale du mélange réactionnel - (réactif + glucose) est voisine de 500 nm. En conséquence, la variation de la densité optique de la réaction finale à une longueur d'onde de 480-520 nm est proportionnelle à la concentration de glucose contenue dans l'échantillon.

La grande popularité de cette méthode pour la détermination du glucose est due à sa grande spécificité et à sa facilité de mise en œuvre. La méthode peut être mise en œuvre à l'aide d'un photomètre conventionnel (meilleur qu'un photomètre biochimique spécialisé tel que Mikrolab 540), ou à l'aide d'autoanalyseurs automatiques biochimiques.

Parallèlement à la méthode photométrique de point final, des kits dans lesquels la méthode photométrique cinétique a été mise en œuvre sont apparus. L’essence de la méthode est qu’à un certain rapport entre les activités de la glucose oxydase et de la peroxydase, le taux de formation d’un composé coloré pendant un certain temps après l’ajout de l’échantillon à la solution de travail sera proportionnel à la concentration de glucose dans l’échantillon. L'avantage de cette méthode est que le résultat ne dépend pas de la présence d'autres composés dans l'échantillon, car l'absorption de ce dernier est stable dans le temps. Cette méthode nécessite l'utilisation d'un photomètre cinétique, par exemple Stat Fax 1904+, Stat Fax 3300, des analyseurs semi-automatiques tels que Clima 15 ou des analyseurs biochimiques automatiques. La mesure de la concentration en glucose dans le sang total est effectuée de manière appropriée à l'aide d'instruments dont le fonctionnement est basé sur le principe de mesure ampérométrique, à l'aide de capteurs enzymatiques spéciaux. Le peroxyde d'hydrogène est un composé chimique extrêmement instable et peut servir de source de particules chargées. C'est ce qui est utilisé dans les capteurs enzymatiques du type à membrane ou dans les éléments électrochimiques des glucomètres portables.

Un échantillon de sang total (généralement 20 µl) est dilué dans une solution tampon système (les globules rouges sont détruits), puis acheminé par une ligne dans une Flow Cell. Le glucose subit une oxydation sous l'influence de l'enzyme glucose oxydase située sur la membrane. Le peroxyde d'hydrogène résultant diffuse à travers la membrane et est ensuite oxydé dans la réaction catalytique sous l'action du platine. La diffusion du peroxyde d'hydrogène à la surface du platine forme un courant proportionnel au nombre de molécules H₂Oh₂. Le signal ainsi obtenu est traité par l'appareil à la valeur de tension correspondante. Cette valeur mesurée est proportionnelle à la concentration de glucose dans l'échantillon.

Comme exemple d'instruments utilisant la méthode décrite ci-dessus, nous pouvons citer les analyseurs de glucose Biosen (Allemagne). Ces dispositifs sont pratiques à utiliser non seulement dans les hôpitaux, mais également dans les polycliniques, où les tests de glycémie sont effectués principalement à partir de sang capillaire.

L'émergence de la "chimie sèche" a été une étape importante dans le développement des méthodes de diagnostic en laboratoire clinique. Naturellement, l’une des premières applications de cette technologie a été la tâche de déterminer le glucose dans le sang du patient. La précision des premiers appareils était bien inférieure à celle des méthodes traditionnelles de recherche en laboratoire. Cependant, au fil du temps, un certain nombre d'entreprises ont réussi à développer de telles bandelettes de diagnostic et photomètres à réflexion, ce qui a permis une très grande précision de l'analyse. Les glucomètres One Touch et les bandelettes réactives Life Scan (USA) sont très populaires dans le monde entier et combinent avec succès la précision analytique de la méthode enzymatique quantitative avec la rapidité et la simplicité de la «chimie sèche».

Les glucomètres One Touch sont conçus pour mesurer rapidement et avec précision le taux de glucose dans le sang total. La bandelette réactive One Touch contient tous les composants chimiques nécessaires à la méthode de la glucose oxydase en deux étapes, y compris les enzymes glucose oxydase et peroxydase, qui sont adsorbées sur une membrane hydrophile poreuse unique. Le résultat de la réaction est la formation d'un complexe coloré. L'intensité de la couleur développée est enregistrée avec un miniphotomètre à réflexion.

La bande de test à membrane One Touch ressemble à une éponge à pores microscopiques et remplit une triple fonction. Il agit: 1) en tant que réservoir, en recueillant la quantité de sang requise, 2) en tant que filtre, en bloquant le matériel cellulaire solide (érythrocytes, leucocytes, etc.), 3) en tant que surface optique lisse sur laquelle la lumière réfléchie est mesurée. Cette dernière fonction, en particulier, est très importante pour le fonctionnement de l'appareil. Il permet de lire la partie inférieure de la bandelette, tandis que le sang reste sur la partie supérieure de la bandelette réactive. En conséquence, il n’est pas nécessaire de laver (éponger) le sang de la surface de la bandelette réactive.

De plus, la membrane a des propriétés hydrophiles, grâce à quoi une goutte de sang «attire» à la surface de la bandelette réactive lorsqu'elle se touche.

L'appareil One Touch comprend deux voyants spéciaux. Le traitement de la couleur développée sur la bandelette réactive est comme suit. Dès que la bandelette réactive est insérée dans le dispositif, la lecture est nulle. A ce moment sur l'écran, nous voyons: "WAIT". Lorsqu'une goutte de sang est appliquée sur la bandelette réactive, le plasma sanguin est instantanément absorbé par la membrane, tandis que les érythrocytes et le plasma en excès restent à la surface de la membrane. Après absorption complète d'une goutte de sang, une coloration se produit immédiatement. L'appareil enregistre la modification de l'amplitude de la réflexion et lance automatiquement le chronomètre. Après 45 secondes, la réaction chimique est terminée, le résultat de la réflexion de la lumière est traité. Le produit de réaction coloré absorbe la lumière émise par la première LED. Les cellules sanguines et l'excès de plasma absorbent également la lumière émise par la diode. Afin de corriger la réflexion de fond, la seconde lecture est effectuée par une seconde LED à une longueur d'onde différente. La différence entre les signaux des première et seconde LED porte des informations sur l'absorption de la lumière par le chromogène. Le signal reçu du chromogène pour estimer la concentration en glucose est mis en corrélation avec un étalonnage spécial. Tous les appareils One Touch sont étalonnés à l'aide de la méthode de référence sur un analyseur de glucose de laboratoire. Avec cette procédure, une courbe d'étalonnage standard est obtenue. Il convient de noter qu'il est assez difficile d'établir la production de bandelettes réactives, qui seraient absolument identiques sur le plan chimique, en raison de la très faible concentration de réactifs. Pour résoudre ce problème, une courbe d'étalonnage standard est utilisée, composée de 16 lignes d'étalonnage. Le contrôle de la qualité est effectué immédiatement après la production des bandelettes réactives, ce qui permet de déterminer quelles lignes d'étalonnage (de 1 à 16) peuvent être appliquées à cette bandelette réactionnelle. C'est ce que l'on appelle le numéro de code, qui est apposé sur l'emballage de la bandelette réactive. Ces 16 lignes d’étalonnage sont également programmées dans le microprocesseur de l’instrument. Pour obtenir des résultats d'une précision optimale, le numéro de code indiqué sur l'emballage de la bandelette réactive est défini dans l'appareil à l'aide du bouton de code. Ainsi, un code mal installé sur l'instrument peut provoquer une erreur de mesure.

Depuis l’arrivée des appareils One Touch sur le marché, un grand nombre d’études cliniques ont abouti dans les laboratoires de Russie, d’Amérique et d’Europe. L'une de ces études a été réalisée par le Centre scientifique d'endocrinologie de l'Académie des sciences médicales de Russie à la demande de l'Association russe du diagnostic en laboratoire médical. Les spécialistes du centre ont procédé à une analyse comparative de deux méthodes de mesure de la glycémie. Les résultats obtenus sur One Touch ont été comparés aux données obtenues sur l'analyseur biochimique Spectrum II (Abbott Laboratories, USA), qui met en œuvre la méthode à l'hexokinase pour la détermination du glucose. 190 échantillons de sang provenant de 95 patients ont été examinés. Le coefficient de corrélation des résultats était de 0,98641. Le coefficient de variation dans les plages normale et pathologique du lecteur One Touch ne dépasse pas 2,5%.

Le rapport officiel du Centre de recherche en endocrinologie de l'Académie des sciences médicales de Russie a déclaré: «Les appareils One Touch ont une précision et une précision élevées, ainsi qu'un large éventail de mesures. Ils peuvent être utilisés pour diagnostiquer les états d’urgence liés au diabète, y compris les équipes d’urgence, car non seulement ces dispositifs sont fiables, mais ils produisent également des résultats rapides. "

Méthode à l'hexokinase

L'enregistrement est effectué à une longueur d'onde de 340 nm sur l'absorption de NADH. Cette méthode est très spécifique et ne réagit pas avec les autres composants du sérum sanguin. La méthode à l'hexokinase est considérée comme une référence pour la détermination du glucose. En règle générale, il est linéaire à 50 mmol / l, ce qui lui a permis d'être largement recommandé pour les cliniques avec des départements endocrinologiques.

Parmi les différentes méthodes décrites pour la détermination du glucose, les employés de QDL peuvent décider eux-mêmes quelle méthode de détermination et quel appareil choisir:

Les méthodes de biochimie «humide», mises en œuvre sur des analyseurs biochimiques automatiques, répondront aux besoins des laboratoires avec un large flux d'analyses.
Les analyseurs de glucose de type Biosen ne nécessitent que peu d'effort de la part de l'opérateur, car ils sont entièrement automatisés et suffisamment productifs (vitesse de 50 à 200 échantillons par heure).
Un photomètre biochimique spécialisé Mikrolab 540 convient parfaitement aux laboratoires comportant un petit nombre d'études, ainsi qu'aux laboratoires express.
Pour les équipes d’aide, masquer l’aide est la solution idéale: des glucomètres tels que One Touch.

Ainsi, la tâche de QDL, qui est d’assurer une détermination du glucose rapide, mais également extrêmement précise, est parfaitement résolue aujourd’hui.

Glycémie, urine, alcool

La glycémie est strictement contrôlée.

Le contrôle de la concentration de glucose dans le sang est effectué par des influences nerveuses et des hormones.

Régulation nerveuse

La régulation nerveuse de la concentration de glucose dans le sang s'exprime par l'effet positif de n.vagus sur la sécrétion d'insuline et par l'effet inhibiteur sur ce processus d'innervation sympathique. En outre, la libération d'adrénaline dans le sang est soumise à des influences sympathiques.

Régulation hormonale

Les principaux facteurs de régulation hormonale sont le glucagon, l'adrénaline, les glucocorticoïdes, l'hormone somatotrope d'une part et l'insuline de l'autre. Toutes les hormones, à l'exception de l'insuline, affectant le foie, augmentent la glycémie.

L'insuline est la seule hormone dans le corps qui vise à abaisser la glycémie. Grâce à son influence, le glucose est fortement absorbé par les muscles et les tissus adipeux.

La diminution de la glycémie par l'insuline est obtenue des manières suivantes:

la transition du glucose dans les cellules - activation des protéines de transport GluT 4 sur la membrane cytoplasmique,
implication du glucose dans la glycolyse - augmentation de la synthèse de la glucokinase, une enzyme appelée piège à glucose, stimulation de la synthèse d’autres enzymes clés de la glycolyse - phosphofructokranase, pyruvate kinase,
synthèse accrue du glycogène - activation de la glycogène synthase et stimulation de sa synthèse, ce qui facilite la conversion du glucose en excès en glycogène,
activation de la voie du pentose phosphate - induction de la synthèse de la glucose-6-phosphate déshydrogénase et de la 6-phosphogluconate déshydrogénase,
lipogenèse accrue - implication du glucose dans la synthèse des triacylglycérols ou des phospholipides.

De nombreux tissus sont complètement insensibles à l'action de l'insuline, on les appelle insulino-indépendants. Ceux-ci incluent le tissu nerveux, le corps vitré, le cristallin, la rétine, les cellules rénales glomérulaires, les cellules endothéliales, les testicules et les globules rouges.

Le glucagon augmente la glycémie:

augmentation de la mobilisation du glycogène par l'activation de la glycogène phosphorylase,
stimuler la gluconéogenèse - augmenter le travail des enzymes pyruvate carboxylase, phosphoénolpyruvate carboxykinase, fructose-1,6-diphosphatase.

L'adrénaline provoque une hyperglycémie:

activation de la mobilisation du glycogène - stimulation de la glycogène phosphorylase,

Les glucocorticoïdes augmentent la glycémie

en supprimant la transition du glucose dans la cellule,
stimuler la gluconéogenèse - augmenter la synthèse des enzymes pyruvate carboxylase, phosphoénolpyruvate carboxykinase, fructose-1,6-diphosphatase.

Le tableau résume les principaux aspects des influences hormonales:

Activation de la glycogénolyse dans le foie;
Stimulation de la gluconéogenèse;

Gluconéogenèse accrue;
Diminution de la perméabilité de la membrane au glucose.

Glycémie en pratique clinique

Le glucose représente plus de 90% de tous les glucides sanguins solubles du sang de faible poids moléculaire; en outre, le fructose, le maltose, le mannose et le pentose peuvent être présents en petites quantités et, en cas de pathologie, le galactose. Avec eux, le sang contient des polysaccharides associés à des protéines.

De manière particulièrement intensive, le glucose est consommé et utilisé pour divers besoins des tissus du système nerveux central, des globules rouges, de la moelle des reins. Dans le métabolisme intermédiaire, le glucose est utilisé pour former du glycogène, du glycérol et des acides gras, des acides aminés, de l'acide glucuronique et des glycoprotéines. La concentration de glucose dans le sang est un dérivé de la glycolyse et de l'oxydation des acides tricarboxyliques dans le cycle du TCA, de la glycogénèse et de la glycogénolyse dans le foie et les tissus musculaires, de la gluconéogenèse dans le foie et les reins et de l'absorption de glucose par l'intestin.

En pratique clinique, les taux de glucose sanguin sont généralement examinés, la concentration d’autres sucres et de glycogène est utilisée beaucoup moins fréquemment. Dans le sang humain, le glucose est réparti assez uniformément entre le plasma et les éléments formés: il a été établi que la teneur en sucre du sang veineux était inférieure de 0,25 à 1,0 mmol / l (en moyenne 10%) à celle du sang artériel et capillaire. La définition des acides lactique et pyruvique, l'activité d'un certain nombre d'enzymes du métabolisme des glucides, les acides sialiques et hexuroniques, les séromucoïdes, l'hémoglobine glycosylée et d'autres indicateurs ont une valeur diagnostique connue.

La teneur en glucose dans l'urine dépend de sa concentration dans le sang, bien qu'il soit excrété dans les taux de sucre sanguin normaux et élevés. Avec une augmentation de la concentration de glucose dans le sang, le seuil rénal est dépassé (chez les personnes en bonne santé, il se situe dans la région de 8,3 à 9,9 mmol / l) et une glucosurie se produit. Avec le rein artérioscléreux, avec le diabète, le seuil augmente et la glucosurie peut ne pas être notée, même avec une augmentation de la concentration en glucose à 11,0-12,1 mmol / l.

Méthodes de détermination de la glycémie

Les méthodes de détermination de la glycémie se divisent en trois groupes: réduction, colorimétrie et enzymatique.

Méthodes de réduction (il convient de noter que les méthodes de ce groupe donnent des résultats surestimés (de 20 à 25% environ), car le sang contient un certain nombre de composés non liés aux glucides, mais ayant des propriétés réductrices (acide urique, glutathion, créatinine, ascorbine). acide)):
- La méthode titrométrique de Hagedorn-Jensen repose sur la propriété du sucre de restaurer, lors de l'ébullition en milieu alcalin, les sels de potassium de fer et sinus et de fer-sludinate. En fonction du degré de récupération, la concentration de sucre dans le sang est étudiée par titrométrie. Un avantage important de la méthode est son faible coût et sa possibilité d’utilisation dans n’importe quel laboratoire;
- sur la base de la réduction de nitrobenzènes, par exemple, l'acide picrique en acide picramique;
- Méthode basée sur la capacité du glucose à réduire les sels de cuivre. Le cuivre monovalent résultant agit comme un intermédiaire. Oxydé par l'oxygène de l'air, il restaure l'acide arsenic-molybdique ou l'acide phosphorotungstique, qui servent de chromogène final.
Méthodes colorimétriques. Ceux-ci incluent:
- Méthode Somodzhi - réaction de réduction du cuivre, qui entre dans la composition du réactif cuivre-orthron, en oxyde cuivreux. La méthode est laborieuse, en plusieurs étapes, non spécifique et pratiquement non utilisée à l'heure actuelle;
- Méthode Folin-Wu - réduction du tartrate de cuivre en oxyde de lithium. La méthode est simple, l’inconvénient est l’absence de proportionnalité stricte entre l’intensité de la couleur obtenue et la concentration en glucose;
- détermination de la concentration en glucose selon Morris et Roe - déshydratation du glucose sous l'action de l'acide sulfurique et sa transformation en oxyméthylfurfural, qui se condense avec un arthron en un composé bleu. Nécessite les réactifs les plus purs et le strict respect de la température de réaction constante;
- La méthode d'orthotoluidine de Gultman dans la modification de Khivarinen-Nikkil, qui consiste à déterminer l'intensité de la coloration en solution qui se produit lorsqu'une amine aromatique, l'orthotoluidine, interagit avec le groupe aldéhyde du glucose en milieu acide. Cette méthode est précise et permet une détermination plus précise du glucose.
- La méthode à l'aniline conserve la sensibilité de la méthode à l'orthotoluidine, mais elle est encore plus spécifique.
Méthodes enzymatiques:
- sur la base de la réaction d'hexokinase. Le glucose sous l'action de l'hexokinase est phosphorylé par l'ATP, le Gl-6-F résultant en présence de déshydrogénase rétablit le NADP. La quantité de ce dernier est déterminée par l'augmentation de l'absorption de la lumière dans la région ultraviolette. La méthode est trop coûteuse pour les laboratoires pratiques.
- sur la base de l'oxydation du glucose en acide glucuronique à l'aide de l'enzyme glucose oxydase et de la formation lors de la réaction de peroxyde d'hydrogène, qui (dans différentes versions):
  - déterminé par des moyens chimiques;
  - avec la participation de la peroxydase, il oxyde l'orthotolidine incolore, en le transformant en un composé de couleur verte-bleue, la rectitude de la dépendance de la couleur sur la concentration en glucose reste dans la plage de 1,1 à 22 mmol / l;
  - en présence de phénol avec la participation de la peroxydase, oxyde la 4 - aminoantipyrine en un composé coloré pourpre;
  - en présence d'ions de cuivre, il oxyde la phénolphtaline en phénolphtaléine, qui est colorée en rouge dans des conditions alcalines.
Procédés électrochimiques utilisant des électrodes contenant des enzymes immobilisées, en particulier la glucose oxydase. La réaction est enregistrée par la quantité de peroxyde d'hydrogène formée ou par la perte d'oxygène consommée pour l'oxydation du glucose.
Bandelettes de diagnostic utilisant la réaction glucose oxydase-peroxydase et des dérivés de benzidine en tant que chromogène.

Trois méthodes ont été adoptées telles qu’unifiées: la méthode titrométrique Haggedorn-Jensen, la méthode ortho-toluidine et la méthode o-tolidine glucose oxydase.

Détermination du glucose par la méthode à l'orthotoluidine

Principe

Le glucose lorsqu'il est chauffé avec de l'orthotolude en présence d'acide sulfurique donne une couleur bleu-vert.